Come ottenere ADSC e SVF, ideali per l’uso clinico di routine, dal tessuto adiposo

Le cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) possono rinnovarsi facilmente, differenziarsi con successo e crescere rapidamente, rendendole eccellenti fonti cellulari nella medicina rigenerativa. Esistono diverse fonti di hMSC, tra cui il midollo osseo (hBMSCs) (1), la cellula staminale della polpa dentaria (hDPSCs) (2), con le membrane placentari fetali (3) e il tessuto adiposo (hADSCs) (4,5), sebbene non sia sempre facile isolarli o utilizzarli nella pratica clinica.

Recenti indagini suggeriscono che ADSCs e la frazione vascolare stromale (SVF, che è costituita da stroma connettivale con funzione di supporto per adipociti e vasi sanguigni), sono facilmente isolati dal tessuto adiposo umano mediante liposuzione e digestione enzimatica.

Diversi studi dimostrano che
le ADSC hanno la capacità di differenziarsi
in diverse linee cellulari (come adipociti, osteoblasti,
cellule cartilaginee,
epatocitie miociti (5-7).

Il gold standard per ottenere ADSC e SVF è la digestione enzimatica, che consente di ottenere rapidamente un gran numero di cellule. Tuttavia, la legislazione europea considera la digestione enzimatica come una manipolazione sostanziale e quindi non fattibile nella pratica clinica. (8).

Come ottenere facilmente ADSC
di alta qualità e SFV, in un modo molto veloce
e standard, che sono ideali
per l’uso clinico di routine?

 

Isolare micro-innesti tissutali con tecnologia RIGENERA-HBW

Rigenera consiste in un dispositivo medico (Classe I), chiamato Rigeneracons e un rotore che consente al dispositivo di ruotare a 80rpm. il dispositivo seleziona, grazie ad una griglia, frammenti di circa 70 micronal cui interno e’ statisticamente rilevante la porzione di cellule progenitrici.

Nel suo studio, De Francesco (nota A) ha confrontato la proprietà biologica delle ADSC ottenute con la digestione enzimatica e la frammentazione meccanica con la tecnologia Rigenera-hbw, analizzando:

  • vitalità e numero di cellule (Trypan blue) a 0, 72 ore e 10 giorni
  • morfologia
  • espressione dei marcatori mesenchimali (citofluorimetria)
  • crescita nella cultura
  • espressione di geni coinvolti nella differenziazione e staminalità (REAL-TIME PCR)

La raccolta del tessuto adiposo è stata eseguita su quattro donne sottoposte a liposuzione a scopo estetico, con età comprese tra i 28-50 anni, (secondo le linee guida etiche stabilite dalla commissione per gli studi sugli AOU “Ospedali Riuniti”, Ancona, Italia) utilizzando il protocollo BEULI con getto d’acqua e cannule da 38 mm. Il tessuto ottenuto è stato lavato due volte con soluzione salina sterile e preparato per la digestione enzimatica o meccanica.

Per la frammentazione di Rigenera: 12 ml di lipo-aspirato sono stati inseriti nei Rigeneracon con 4 ml di terreno di coltura. La frammentazione è stata eseguita per 30 e 45 s, al fine di determinare quale dei due tempi era più adatto per ottenere una migliore frazione stromale vascolare, senza influire sulla sua vitalità.

Per la digestione enzimatica:
la parte rimanente è stata digerita con il protocollo standard per collagenasi, quindi centrifugata e filtrata su un filtro da 70 micron. Entrambe le sospensioni sono state coltivate per la successiva analisi.

I risultati di questo studio dimostrano che:
nella sospensione ottenuta con la lavorazione di
12 ml di lipoaspirato con Rigenera ci sono circa
4200 cellule vitali, con forma allungata,
membrana e nucleo intatti.
In alcune cellule sono presenti piccole gocce lipidiche.
Il numero di celle, se confrontato
con la digestione enzimatica, è più basso,
ma la vitalità è alta su tutto il periodo
(0, 72 ore e 10 giorni),
e anche la proliferazione è ottima

L’analisi citofluorimetrica dimostra che le cellule ottenute con RIGENERA hanno:

  • alta positività ai marcatori stromali mesenchimali CD105, CD90, CD73, CD117), come precedentemente descritto (9)
  • negatività per i marcatori ematopoietici (CD31, CD 45)

Al fine di confermare il potenziale come una cellula staminale di cellule isolate l’mRNA di CD73, CD105, CD90, CD45 e CD34 sono stati estratti e misurati mediante PCR in tempo reale, la digestione dei grassi enzimatici è stata utilizzata come controllo. Un’espressione di mRNA significativamente comparabile per tutti i marcatori delle cellule staminali è stata rilevata nel metodo Rigenera rispetto alla digestione enzimatica. Non sono state rilevate differenze tra 30 e 45 secondi.

In conclusione, la digestione enzimatica,
che è attualmente la procedura di riferimento ,
fornisce un elevato numero di
cellule stromali di derivazione adiposa e di SVF da tessuto adiposo,
mentre la frammentazione meccanica con Rigenera
permette di ottenere una aggregazione cellulare con le stesse caratteristiche
e stessa qualità , ideali per l’uso clinico di routine.
Inoltre, questo protocollo è semplice, rapido e riproducibile, capace di
fornire cellule stromali derivate da tessuto adiposo, ricche di
frazione vascolare stromale.

(Nota A) Questo documento si basa sul seguente articolo: De Francesco et al Un metodo non enzimatico per ottenere un derivato del tessuto grasso altamente arricchito in cellule staminali adipose (ASC) da lipoaspirati umani: risultati preliminari. 2018 Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2061; doi: 10,3390 / ijms19072061

REFERENZE 1. Verna, P.; Bansal, H.; Agrawal, A.; Leon, J.; Sundell, I.B.; Koka, P.S. Evaluation of bone marrow processing protocol for therapeutic applications via culture and characterization of mesenchymal stem cells. J. Stem Cells 2016, 11, 3–13. 2. Koyama, N.; Okubo, Y.; Nakao, K.; Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. J. Oral Maxillofac. Surg. 2009, 67, 501–506. 3. Pozzobon, M.; Piccoli, M.; De Coppi, P. Stem cells from fetal membranes and amniotic fluid: Markers for cell isolation and therapy. Cell Tissue Bank. 2014, 15, 199–211. 4. De Francesco, F.; Ricci, G.; D’Andrea, F.; Nicoletti, G.F.; Ferraro, G.A. Human adipose stem cells: From bench to bedside. Tissue Eng. Part B Rev. 2015, 21, 572–584. 5. Strem, B.M.; Hicok, K.C.; Zhu, M.; Wulur, I.; Alfonso, Z.; Schreiber, R.E.; Fraser, J.K.; Hedrick, M.H.Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J. Med. 2005, 54, 132–141. 6. Ferraro, G.A.; De Francesco, F.; Nicoletti, G.; Paino, F.; Desiderio, V.; Tirino, V.; D’Andrea, F. Human adipose CD34+ CD90+ stem cells and collagen scaffold constructs grafted in vivo fabricate loose connective and adipose tissues. J. Cell. Biochem. 2013, 114, 1039–1049. 7. Gardin, C.; Bressan, E.; Ferroni, L.; Nalesso, E.; Vindigni, V.; Stellini, E.; Pinton, P.; Sivolella, S.; Zavan, B.In vitro concurrent endothelial and osteogenic commitment of adipose-derived stem cells and their genomical analyses through comparative genomic hybridization array: Novel strategies to increase the uccessful engraftment of tissue-engineered bone grafts. Stem Cells Dev. 2012, 21, 767–777. 8. Nicoletti, G.F.; De Francesco, F.; D’Andrea, F.; Ferraro, G.A. Methods and procedures in adipose stem cells: State of the art and perspective for translation medicine. J. Cell Physiol. 2015, 230, 489–495. 9. Trovato, L.; Monti, M.; Del Fante, C.; Cervio, M.; Lampinem, M.; Ambrosio, L.; Redi, C.A.; Perotti, C.; Kankuri, E.; Ambrosio, G.; et al. A new medical device rigeneracons allows to obtain viable micro-grafts from mechanical disaggregation of human tissues. J. Cell Physiol. 2015, 230, 2299–2303. 10. Purpura, V.; Bondioli, E.; Graziano, A.; Trovato, L.; Melandri, D.; Ghetti, M.; Marchesini, A.; Cusella De Angelis, M.G.; Benedetti, L.; Ceccarelli, G.; et al. Tissue characterization after a new disaggregation method for skin micro-grafts generation. J. Vis. Exp. 2016, 4, e53579. 11. Viganò M.; Tessaro I.; Trovato L.; Colombini A.; Scala M.; Magi A.; Toto A.; Peretti G.; De Girolamo L. Rationale and pre-clinical evidences fot the use of autologous cartilage micrografts in cartilage repair. J of Orthopaedic Surgery and Research. 2018, 13:279 12. Lampinen M., Nummi A., Nieminen T., Harjula A. and Kankuri E. Intraoperative processing and epicardial transplantation of autologous atrial tissue for cardiac repair Transplantation of autologous atrial micrografts, Journal of Heart and Lung Transplantation. 2017, (dx.doi.org/10.1016/j.healun.2017.06.002)